ناهنجاری در تعداد یا ساختار کروموزم­ها از علل مهم ایجاد نقص­های مادرزادی به شمار می­روند. اختلالات عددی کروموزومی 21، 18، 13، X و Y از شایع ترین اختلالات کروموزومی می­باشد. غربالگری دوره بارداری در بسیاری از کشورهای جهان در حال انجام است. رایجترین روش برای تشخیص، روش سیتوژنتیک می­باشد اما این روش حداقل به دو هفته زمان نیاز دارد در صورتیکه روش مولکولی موسوم به QF PCR در زمان کوتاهی قابل انجام است.

در طی 10 سال اخیر تکنیک فلورسنت کمی (QF-PCR) برای تشخیص سریع پیش از تولد آنوپلوئیدی­های کروموزومی شایع بکار گرفته شده است. در این روش با مارکرهای تکرارهای کوتاه (STRs) موجود بر روی کروموزوم­های 21، 18، 13، X و Y  DNA  تکثیر شده و با نشانگرهای فلورسنتی نشانه گذاری و نهایتا مقدار آنها با الکتروفورز اندازه گیری می­شود.

QF-PCR  در چه مواردی استفاده می­شود:

تشخیص سریع اختلالات کروموزوم­های آتوزوم شامل سندرم داون(+21)، سندرم ادوارد(+18) و سندرم پاتو (+13)

بررسی سلامت جنین در صورت مشکوک بودن نتایج غربالگری سه ماهه اول

تعیین جنسیت جنین

تشخیص سریع اختلالات کروموزوم­های جنسی X و Y سندرم ترنرXO، سندرم کلاین فلترXXY، سندرم X سه گانه XXX، سندرم جاکوب  XYY 

تشخیص انواع پلی پلوئیدی(تریپلوئیدی) در جنین یا جنین سقط شده

بررسی سریع اختلالات کروموزومی در مواردی که امکان کشت سلولی فراهم نباشد و یا زمان کافی برای کشت سلولی ندارند.

بررسی کروموزومی نمونه جنینی برای خانم­هایی که احتمال اختلال کروموزومی در آن­ها بیشتر است توصیه می­شود، از جمله:

سن بالای 35 سال در هنگام بارداری

جواب آزمایشات حین بارداری موسوم به تست سه گانه یا چهارگانه،(Triple Test, Quadruple Test)  مشکوک به وجود اختلالات کروموزومی باشد.

جواب سونوگرافی حین بارداری مشکوک به اختلال کروموزوم در جنین باشد.

داشتن فرزند مبتلا به اختلال کروموزومی(زنده یا فوت شده)

داشتن اختلال کروموزومی متعادل در خود یا همسر

درخواست آزمایش کروموزومی حین بارداری توسط پزشک

خانم باردار می‌بایست در سن 11-10 هفته بارداری به متخصص زنان مراجعه نماید که بعد از انجام سونوگرافی و آزمایش­های دو گانه، سه گانه و یا چهار گانه (Double, Triple or Quadruple Test) نزد سونوگرافیست مجرب، وضعیت جنین تا حد زیادی مشخص خواهد شد. اگر این آزمایش‌ها دقیق انجام شوند دقت آزمایش حداکثر 85% می­باشد. در صورتی که سن خانم­ها بالاتر از 35 سال باشد و یا آزمایش‌های فوق احتمال وجود مشکل در جنین را نشان دهد بررسی ژنتیکی کروموزوم­ها می بایست انجام شود. از آنجایی که در ایران بعد از هفته 18 بارداری سقط درمانی غیر قانونی می باشد لازم است نتایج همه آزمایش‌ها تا قبل از اتمام هفته 18 بارداری مشخص شوند. لذا توصیه می­شود چنانچه در مراجعات خانم­ها برای انجام آزمایش‌های کروموزومی، سن بارداری بعد هفته 15 باشد از روش بررسی سریع اختلال کروموزومی موسوم به QFPCRاستفاده کرد. این روش معمولا در عرض 48 ساعت به نتیجه می­رسد ولی بررسی کروموزومی 2-4 هفته به طول می­انجامد. روش QF PCR سریع و نسبتا ارزان می­باشد و اطمینان خاطر را برای خانواده­ها فراهم می­آورد. این روش از روش­های معمول سیتوژنتیکی سریع­تر و ارزانتر می­باشد و دقت آن بیش از 99% می­باشد. پرزهای جفتی یا مایع آمنیوتیک حاوی سلول با برچسب نام و مشخصات نمونه به همراه نمونه خون وریدی مادر (5 تا 10 میلی لیتر) در لوله آغشته به ماده ضد انعقاد (EDTA) می بایست به آزمایشگاه ارسال گردد. در برخی موارد که نتیجه آزمایش مبهم است نمونه خون مادری برای تشخیص بهتر مورد استفاده قرار می­گیرد. کلیه نمونه­های پرزها و مایع آمنیوتیک بوسیله QF-PCR مورد آزمایش قرار می­گیرد و در صورتی که علائم و نشانه­های مشخص بالینی ابتلا به بیماری در جنین وجود داشته باشد، کاریوتایپ نیز به همراه این آزمایش صورت می­گیرد.

اساس کار QF PCR

نمونه­گیری جنینی پس از هفته دوازدهم بارداری

استخراج DNA از پرزهای کوریونی و یا مایع آمنیون

انجام PCR با استفاده از کیت اختصاصی QF-PCR

آنالیز نمونه­ها درون دستگاه Genetic Analyzer

 

آنالیز نهایی نمونه­ها با استفاده از نرم افزار Gene Mapper

 

 

 

 

فواید بکارگیری تکنیک QF-PCR چیست؟

فواید اين روش حساسيت و ویژگی بالای آن می­باشد که ناهنجاری­هاى كروموزومى عمده را تشخيص می­دهد.

بخش عمده­ی این تست بطور اتوماتيك انجام می­شود و همين امر باعث توان عملياتى بالا با صرف هزينه­اى بسيار كم می­گردد و همچنين تشخيص پيش از تولد سريع را براى كليه بارداری­ها امكان­پذير می­سازد. به همين علت اضطراب حاصل از انتظار دراز مدت والدين براى تكميل نتايج آزمايش كاريوتايپ را كاهش داده است.

اين روش داراى حساسيت بسيار بالايى است و در نتيجه نمونه بسيار كمى مورد نياز است.

در این تکنیک به علت استفاده از مارکرهای STR که بسیار پلی­مورف یا چندشکل هستند، انجام آزمایش بر روی نمونه­های جنینی که آلوده به سلول­های مادری است امکان­پذیر می­شود و نیز امکان ارزیابی کیفیت تخم لقاح شده در بارداری­های چندقلو وجود دارد.

بکارگیری STR های مختلف با اشکال متفاوت و خاص کروموزومی نیز تشخیص تریزومی­های جزئی (partial trisomy’s) را امکان­پذیر می­سازد.

مقایسه روش QF PCR با روش­های سیتوژنتیکی

دقت این روش در مقایسه با روش­های سیتوژنتیکی بیش از 99.4 درصد می­باشد.

در مقایسه با هزینه نسبتا بالای آزمایش­های کروموزومی که آزمایشگاه­های کشور برای بررسی کروموزومی حین بارداری برای چنین آزمایش­هایی دریافت می­کنند هزینه این آزمایش کمتر از نصف می­باشد.

بررسی با روش­های سیتوژنتیکی معمولاً بیشتر از 2 هفته طول می­کشد در صورتیکه با روش مولکولی در کمتر از 48 ساعت جواب حاضر است.

با استفاده از نمونه غیر زنده (مانند جنین سقط شده یا مرده زاد یا فوت بعد از تولد) می­توان آزمایش QF PCR را انجام داد در صورتیکه با روش­های سیتوژنتیکی نمونه می بایست از موجود زنده تهیه شود.

با روش QF PCR در هفته 10 بارداری به بعد امکان بررسی وجود دارد ولی برای روش معمولی کروموزومی که معمولا از مایع آمنیون استفاده می­شود، سن جنین باید حداقل 12 هفته باشد.

با این روش، در صورتیکه جنین مبتلا باشد، فرصت کافی برای سقط جنین وجود دارد ولی با روش سیتوژنتیکی ممکن است فرصت کافی وجود نداشته باشد. مثلاً اگر خانمی بخواهد آزمایش­های سه گانه (Triple Test) و سونوگرافی را انجام دهد حتی اگر لازم به تکرار آزمایش نباشد از شروع تا نتیجه آزمایش­ها حداقل 2 هفته وقت لازم است. همچنین اگر لازم به آزمایش کروموزومی باشد و بررسی انجام شود حداقل 2 هفته دیگر وقت لازم است. لذا 5-4 هفته از وقت محدود دوره بارداری صرف بررسی اولیه و کروموزومی می­شود و اگر قبول کنیم که جواب سونوگرافی در هفته 13 و آزمایشات سه گانه (Triple Test) در هفته­های 14 به بعد بهتر مشخص می­شود، لذا زمانی که نتیجه آزمایش­ها با روش­های معمولی مشخص شود در اکثر موارد زمان سقط (نهایتا تا هفته 18 بارداری) گذشته و امکان سقط جنین به روش قانونی وجود نخواهد داشت ولی با روش مولکولیQF PCR  حتی اگر نمونه­گیری بعد از هفته 15 بارداری انجام شود 48 ساعت بعد یعنی قبل از اتمام هفته 15 نتیجه بررسی کروموزومی مشخص می­شود.

انجام همزمان QF-PCR و MLPA

توجه به این ‌نکته لازم است که در حال حاضر اخذ مجوز ختم بارداری از طریق پزشکی قانونی تنها با در دست داشتن نتیجۀ QF-PCR  میسر نیست، اما چنانچه نتیجۀ حاصله توسط تکنیک دیگری نظیر MLPA تأیید گردد، امکان ختم بارداری وجود خواهد داشت. ما این امکان را فراهم کرده‌ایم که با انجام تکنیک MLPA به طور همزمان باQF-PCR ، به فاصلۀ حدوداً ٣ روز پس از ارائۀ نمونه به آزمایشگاه، خانواده برای اخذ مجوز سقط جنین مبتلا به پزشکی قانونی ارجاع داده شود. توصیه: در شرایطی که زمان برای ختم بارداری واقعاً محدود باشد، توصیه می­شود آزمایش QF-PCR و MLPA به ‌صورت همزمان با کشت کروموزومی درخواست شود.

محدودیت آزمایش‌های QF-PCR و MLPA

محدودیت آزمایش‌های QF-PCR و MLPAعدم قدرت تشخیص درجات پایین موزاییسم و همچنین عدم قدرت تشخیص اختلالات در کروموزوم‌های دیگر به غیر از کروموزوم‌های ١٣، ١٨، ٢١، X و Y است.

مزایای آزمایش‌های QF-PCR و MLPA

مزیت اصلی این آزمایش‌ها امکان جواب‌دهی در زمانی کوتاه است. همچنین برخورداری از حساسیت و اختصاصیت بالا و عدم تأثیرپذیری از سن بارداری نیز از جمله مزایای مهم این تکنیک محسوب می­شود.

گروه ژنتیک کدون در راستای ارائه خدمات به آزمایشگاه­های کشور، آمادگی پذیرش نمونه جهت خوانش قطعات پس از انجام واکنش PCR و همچنین مشاور جهت اجرا روند آزمایش کمی سنجی را دارد.