در این روش با طراحی مجموعهای از پروبها که هرکدام مکمل ناحیه مشخصی از ژنوم میباشند، تعداد نسخه ژنی (deletion,duplication) در یک منطقه را میتوان مشخص نمود. اساس این روش بر پایه هیبرید شدن هر جفت پروب با توالی مشخصی در ژنوم به صورت اختصاصی میباشد. به طوری که حتی تغییر یک نوکلئوتید در محل اتصال 2 پروب قابل شناسایی است و از این خصوصیت میتوان برای طراحی پروبهای اختصاصی جهت بررسی جهشهای نقطهای شناخته شده نیز استفاده نمود. مزیت روش MLPA در آن است که میتوان تعداد نسخه ژنی (deletion,duplication) با محدوده نامشخص را به راحتی و سریع مشخص کرد، در صورتیکه در روش Real-Time می بایست محل حذف و یا اضافه شدگیها مشخص باشد. MLPA تکنیکی است که در سال 2002 در راستای کمی سنجی با بازدهی بالا ابداع شد. در این تکنیک که مبتنی بر اتصال پروبهای اختصاصی با طول های منحصر به فرد است، امکان بررسی همزمان 50 قطعه مختلف نوکلئوتیدی در یک واکنش وجود دارد. روش MLPA توسط شرکت MRC هلند که در سال 1985 شروع به کار کرد که به سرار جهان معرفی شد. امروز بیش از 250 کیت تجاری مختلف توسط این شرکت به بازار عرضه میشود که در حوزههای ژنتیک انسانی، سیتوژنتیک و تحقیقات سرطان کاربرد دارند.
موارد کاربرد MLPA
- بررسی del/dup در ژنوم به ویژه del/dup بزرگ با محدوده نامشخص، del/dup در برگیرنده اگزونهای متعدد مانند بررسی ژن دیستروفین در افراد مشکوک به دیستروفی عضلانی دوشن (با این روش علاوه بر تشخیص بیماران، به سادگی میتوان ناقلین را شناسایی کرد).
- بررسی تعداد نسخه ژنی در محلهای خاصی در کروموزومهای مختلف جهت screening ژنهای مختلف.
- بررسی جهشهای نقطهای و پلی مورفیسمهای (SNP’s) شناخته شده
- بررسی کمی mRNA
- بررسی وضعیت متیلاسیون مناطق پروموتری و یا imprinted
- بررسی DNA استخراج شده از بافت paraffin imbedded یا formalin treated
مراحل انجام آزمایش MLPA
اساس این روش بر پایه هیبرید شدن هر جفت پروب با توالی مشخصی در ژنوم به صورت اختصاصی میباشد. به طوری که حتی تغییر یک نوکلئوتید در محل اتصال 2 پروب قابل شناسایی است و از این خصوصیت می توان برای طراحی پروبهای اختصاصی جهت بررسی جهشهای نقطهای شناخته شده نیز استفاده نمود. هر پروب MLPA از دو پروب الیگونوکلئوتیدی تشکیل شده است. اگر توالی هدف پروب در نمونه تست وجود داشته باشد هر دو پروب در کنار یکدیگر به نواحی اختصاصی هیبرید میشوند. درمرحلهی بعد پروبهای هیبرید شده توسط یک لیگاز حساس به حرارت به یکدیگر متصل میشوند و در نهایت در مراحل بعد به روش PCR تکثیر میگردند، PCR در روش MLPA به علت وجود یک توالی برای پرایمر که در همهی پروبها یکسان است، بسیار با قدرت انجام میپذیرد. هر پروب MLPA یک محصول PCR با طول قطعه منحصر به فرد خود را دارد که این موضوع به علت وجود یک توالی Stuffer منحصر به فرد برای هر یک از پروبها میباشد. در نهایت محصول PCR برای آنالیز به دستگاه ژنتیک آنالیزر منتقل میگردد و در نهایت الکتروفورگرام به صورت شکل زیر جهت آنالیز متخصصین ارائه میگردد.
| |
| |
 |
همانطور که در شکل مشاهده میشود یک واکنش MLPA برای ژنهای مختلف به صورت همزمان انجام شده و از طریق مقایسه ارتفاع پیکها با نمونه کنترل آنالیزها انجام میشود MS-MLPA(Methylation Specific-MLPA) در این روش تغییرات متیلاسیون علاوه بر تغییرات تعدادی در یک واکنش انجام میشود، کاربرد این روش در بیماریهای با تغییرات اپی ژنتیکی و علامت گذاری ژنومی (Imprinting) می باشد، از جمله در مواردی مانند سندرومهای پرادرویلی/آنجلمن و بک ویت وایدمن/راسل سیلور استفاده میشود. در این روش در صورت متیلاسیون نقطه موردنظر امکان برش آنزیمی وجود ندارد و در نهایت پروبها به یکدیگر منتقل شده و محصول PCR وجود خواهد داشت.
مزایای استفاده از MLPA
امکان بررسی همزمان 40 تا 50 محل مختلف ژنومی در یک واکنش PCR نیاز به میزان کم DNA برای انجام این آزمایش نیاز به یک دستگاه ترموسایکلر و سیستم الکتروفورز کاپیلری (sequence type) میباشد. در صورت در دسترس نبودن سیستم الکتروفورز کاپیلری، محصول نهایی PCR را میتوان در دمای 4 درجه نگهداری و به مراکز دیگر ارسال نمود. سرعت جوابدهی با توجه به حجم اطلاعات به دست آمده، بالا میباشد. بهطوریکه میتوان طی 24 ساعت کلیه مراحل تا تفسیر را انجام داد. هزینه هر واکنش با توجه به حجم اطلاعات به دست آمده، بسیار مناسب میباشد. این روش از دقت و قدرت (robustness) بالایی برخوردار است. زیرا فقط از یک جفت پرایمر برای انجام تکثیر استفاده میشود و مشاهده سیگنال در هر محل، حاصل هیبرید شدن 2 پروب مستقل با ویژگی بالا در حد یک نوکلئوتید میباشد. روش کار یکسان برای کاربردهای گوناگون تمامی مواد لازم در یک کیت موجود میباشد. انجام همزمان QF-PCR و MLPA توجه به این نکته لازم است که در حال حاضر اخذ مجوز ختم بارداری از طریق پزشکی قانونی تنها با در دست داشتن نتیجۀ QF-PCR میسر نیست، اما چنانچه نتیجۀ حاصله توسط تکنیک دیگری نظیر MLPA تأیید گردد، امکان ختم بارداری وجود خواهد داشت. ما این امکان را فراهم کرده‌ایم که با انجام تکنیک MLPA به طور همزمان باQF-PCR ، به فاصلۀ حدوداً ٣ روز پس از ارائۀ نمونه به آزمایشگاه، خانواده برای اخذ مجوز سقط جنین مبتلا به پزشکی قانونی ارجاع داده شود. توصیه: در شرایطی که زمان برای ختم بارداری واقعاً محدود باشد، توصیه میشود آزمایش QF-PCR و MLPA به صورت همزمان با کشت کروموزومی درخواست شود. محدودیت آزمایش‌های QF-PCR و MLPA محدودیت آزمایش‌های QF-PCR و MLPAعدم قدرت تشخیص درجات پایین موزاییسم و همچنین عدم قدرت تشخیص اختلالات در کروموزومهای دیگر به غیر از کروموزومهای ١٣، ١٨، ٢١، X و Y است. مزایای آزمایش‌های QF-PCR و MLPA مزیت اصلی این آزمایش‌ها امکان جوابدهی در زمانی کوتاه است. همچنین برخورداری از حساسیت و اختصاصیت بالا و عدم تأثیرپذیری از سن بارداری نیز از جمله مزایای مهم این تکنیک محسوب میشود.